（来源：课题指南针 小张聊科研）

      中药单体研究最容易陷入的误区，是观察到某条通路变化后，就把通路中的某个蛋白称为“靶点”，但凡要发好一点的文章，审稿人的第一个问题就是：单体直接结合谁？紧接着的问题是：如果是胞内靶点，那它能否进入细胞？结合发生在什么位点？这一结合如何改变蛋白功能或稳态？这种改变是否足以解释细胞、动物乃至临床相关模型中的药效？

今天我们介绍下中药单体研究的两条常规思路，一条是基于靶蛋白垂钓检测，从“单体—蛋白互作”出发筛靶点；另一条是在不做靶蛋白垂钓的情况下从化学结构出发预测靶点。前者更有说服力，也更容易找到新靶点，后者更方便快捷且省钱。

思路一：先找互作蛋白，再从候选中锁定真靶点

这是最常用也最可靠的方式，适合大部分中药单体化合物。一般研究思路是：先确认药效→靶蛋白垂钓→多方法验证直接结合→突变定位结合位点→敲低、过表达或救援验证靶点依赖→组学追踪下游→细胞与动物闭环。

其中靶蛋白垂钓包括体内、体外两种方式，体外就是直接将标记的中药单体与靶细胞裂解液孵育，体内需要先设计并验证活性探针，再用探针处理活细胞进行探针富集/母体竞争筛选。若不便改造化合物，也可用DARTS、CETSA等“无标记”蛋白质组学替代探针富集。

1、标记中药分子进行靶蛋白筛选：

接下来我们以这篇去年讲雷公藤红素（Celastrol，Cel）的APS文章为例仔细看看如何利用标记中药分子进行靶蛋白筛选。

作者先确认Cel可抑制三阴性和ER阳性乳腺癌细胞增殖，并在同系移植与细胞源性异种移植模型中抑制肿瘤生长，由此建立可靠药效表型。随后把可点击的炔基接到Cel上，制成仍保留生物活性的探针Cel-P。活性验证是关键：如果探针已失去原化合物的效应，后续抓到的蛋白就可能是“探针靶点”，而非单体靶点。

在活细胞中，作者设置溶剂对照、探针组和“母体化合物预竞争+探针”组，经点击化学接入荧光或生物素标签，再用亲和富集和LC-MS/MS比较蛋白丰度。只有既被探针显著富集、又能被过量Cel竞争掉的蛋白，才进入高置信候选集。150个候选中，线粒体异柠檬酸脱氢酶IDH3A最突出，IDH2也被纳入共同靶点，统称mito-IDHs。

“筛到”之后还要逐层排除假阳性。研究用竞争性pull-down、细胞热转移分析（CETSA）、细胞共定位、重组蛋白标记和微量热泳动（MST）证明直接结合；再结合分子对接和位点突变，锁定IDH3A的Cys127及IDH2的Cys336。接着以酶活、代谢物、线粒体呼吸和遗传学实验建立因果：Cel抑制mito-IDHs活性，引起α-酮戊二酸积累、氧耗和膜电位下降、ROS升高；敲低IDH3A会削弱Cel的抑癌效应。最后通过互作蛋白质组发现，Cel增强IDH3A与DPYSL2在线粒体中的结合，使胞质DPYSL2减少，继而抑制JAK/STAT信号，诱导铁死亡和凋亡。至此，“直接结合—酶功能改变—代谢重编程—信号转导—死亡表型—体内药效”形成闭环。

2、无标记蛋白质组学筛选靶蛋白

有些中药分子可能没有比较好的标记修饰位点，前面那种标记中药分子再进行质谱检测的方式可能就不太适用，这时可以使用DARTS、CETSA等“无标记”蛋白质组学替代探针富集，研究思路也大差不差，以下面这篇扁塑藤素（Pristimerin）的文章为例。

作者先从细胞死亡抑制剂和RNA测序发现自噬、凋亡及ERK激活，再用DARTS-MS寻找被药物结合后更耐蛋白酶水解的蛋白，结合CETSA、SPR和分子对接锁定HSPA8。随后发现扁塑藤素促进CHIP介导的HSPA8泛素化降解，使HSPA8不再通过伴侣介导自噬降解其客户蛋白VAV1，VAV1因而积累并激活ERK，推动自噬性死亡和凋亡。HSPA8或VAV1敲低会削弱药效，动物模型及与多柔比星联用又把机制延伸到疗效和耐药。

思路二：从结构出发预测靶点，再把计算结果变成实验证据

第二种思路就是没有做靶蛋白垂钓和蛋白质组学检测，用计算机结构预测替代前期的筛选工作，这个方法的研究门槛相对较低，但是需要有对应的结构知识，不过最近的AI模型发展迅速，可以尝试在AI的帮助下自行探究摸索，性价比很高就是需要费些精力。我们以这篇讲蟾毒灵（Bufalin）的NC文章为例。

作者根据蟾毒灵的结构，整合FMBS方法及SwissTarget Prediction、SEA、PPB2、ChEMBL等平台中蟾毒灵的互作蛋白预测，得到53个交集候选；经KEGG富集聚焦肿瘤相关通路，压缩至11个靶点；再以Chemprop图神经网络进行多任务预测，最终得到CYP17A1、ESR1、mTOR、AR和PRKCD等5个高置信候选。

随后，作者用表面等离子共振（SPR）比较候选蛋白，发现蟾毒灵对ESR1编码的ERα结合最强，并用生物素化蟾毒灵pull-down、竞争实验、CETSA和共定位确认直接结合。分子对接、100 ns分子动力学和MM-GBSA能量分解提出关键残基，点突变实验进一步证明：只有ERα Arg394突变明显削弱蟾毒灵结合、泛素化及降解。

接着作者利用计算机模拟蟾毒灵对ERα与多种E3连接酶互作的影响，预测其可显著稳定ERα-STUB1三元复合物；200 ns模拟显示蛋白界面面积和氢键增加。随后用Co-IP和STUB1敲低证明蟾毒灵像“分子胶”一样增强ERα-STUB1结合，经泛素—蛋白酶体途径降解ERα。最终，ERα敲低削弱药效，而蟾毒灵在他莫昔芬耐药细胞、耐药移植瘤及患者来源类器官中均显示活性，使结构预测落到了治疗耐药这一真实问题上。

这篇文章充分地运用了机器学习和计算机模拟，我们在做自己的课题时其实只需要两步计算机模拟，一是找靶蛋白，二是初步验证，也不需要像这篇文章一样利用多个数据库进行模拟，当然利用多个数据库和机器学习能够大大提高理论的可行性，降低后续实际验证的失败概率，但最终还是要以实验结果为准。

中药单体药理研究的核心还是要像其他小分子化合物药一样，用实验证明其分子机制和有效性。互作蛋白筛选更接近真实细胞环境，结构预测更高效、也更容易提出结合位点和三元复合物假说；二者并非竞争关系，完全可以先用一条路线发现候选，再用另一条补强结构解释。无论从哪条路出发，最终都应回到同一标准：直接结合有证据、靶点依赖可干预、下游机制能救援、体内药效可复现，这些都做清楚了该中药单体才有可能成为一个先导化合物，对应的成果才能申请基金项目，最后发到较好的期刊。